Forschungsgebiete
Wir untersuchen Enzyme, die C-C-Bindungen knüpfen oder spalten können, da diese sich als Biokatalysatoren in chemo-enzymatischen Synthesen eignen, um z.B. neuartige hydroxylierte Verbindungen herzustellen. Wir beschäftigen uns außerdem mit der gezielten Veränderung der Stoffwechselwege von E. coli und Corynebacterium glutamicum für die Produktion von aromatischen Verbindungen, z.B. Aminosäuren wie Phenylalanin oder Tryptophan, Violacein und anderen Feinchemikalien.
Enzyme, die C-C-Bindungen knüpfen oder spalten können, eignen sich als Biokatalysatoren in chemo-enzymatischen Synthesen um z.B. neuartige Zucker, Zuckeranaloge oder hydroxylierte Verbindungen herzustellen. In unserer Arbeitsgruppe untersuchen wir dazu Enzyme aus dem Zentralstoff- und Baustoffwechsel von Escherichia coli wie Aldolasen und Thiamindiphosphat (ThDP)-abhängige Enzyme.
Bei den Aldolasen untersuchten wir die Transaldolase (TAL) und die strukturverwandte, neuartige Fruktose-6-Phosphat-Aldolase (FSA) und deren Mutantenproteine (Muteine). In Kooperation mit Prof. Gunter Schneider am Karolinska-Institut in Stockholm wurden die dreidimensionalen Strukturen der TAL und einiger TAL-Muteine gelöst. Erstmals für Aldolasen wurde dabei der Enzym:Substratkomplex des Typs einer Schiff´schen Base aufgeklärt. Ebenso wurde die Struktur des dekameren Enzyms FSA gelöst. Durch ortsgerichtete Mutagenesen wurden die aktiven Zentren der Enzyme verändert und diese „Muteine“ wurden danach auf ihre Katalyseeigenschaften untersucht. In Zusammenarbeit mit der AG von Prof. W.D. Fessner an der TU Darmstadt wurde die gerichtete Evolution der Transaldolase zur Gewinnung neuer Enzymeigenschaften erfolgreich untersucht. So konnten Mutantenproteine mit neuartigen oder verbesserten Eigenschaften erhalten werden (z.B. Dihydroxyaceton als Donorsubstrat für TAL-Reaktionen; unphosphorylierte Aldehyde als Akzeptorsustrate). Wir verfügen somit über verschiedene TAL- und FSA-Mutantenproteine, die den Zugang zu interessanten neuen Zuckern und Zuckeranaloga aus chemo-enzymatischen Synthesen ermöglichen. Dies konnten wir in Zusammenarbeit mit verschiedenen Arbeitsgruppen (Fessner, Lemaire, Clapés) unter Beweis stellen. Ein DFG-Projekt (Dr. Anne Samland) beschäftigte sich mit den Determinanten der Substrat- und Stereoselektivität von Dihydroxyaceton verwertenden Transaldolasen und FSA. Eine Variante von FSA mit dem Aminosäureaustausch Ala129>Ser (A129S) zeigt deutlich verbesserte katalytische Effizienz gegenüber Fruktose-6-Phosphat. Diese Eigenschaft konnten wir kürzlich erfolgreich zur Umlenkung der Glykolyse in einer E. coli-Mutante einsetzen, der die Funktionen der Phosphofructokinase und der Glucose-6-Phosphatdehydrogenase fehlen.
Verschiedene Thiamindiphosphat (ThDP)-abhängige Enzyme können – neben ihren Funktionen im Stoffwechsel- auch als Biokatalysatoren für C-C-Bindungsknüpfungen verwendet werden. In der Vergangenheit untersuchten wir die Transketolase (TKT), die strukturverwandte 1-Desoxyxylulose 5-Phosphat-Synthase (DXS) aus E. coli und die Phosphonopyruvat-Decarboxylase (PPDC, aus Streptomyces viridochromogenes).
Im Rahmen einer DFG-Forschergruppe (For 1296) untersuchten wir in Kooperation mit der AG von Jürgen Pleiss (ITB, Univ. Stuttgart) und Michael Müller (Univ. Freiburg) die Verwendung des Enzyms MenD (SEPHCHC-Synthase) als neuartigem Biokatalysator für 1,2- und 1,4-Additionen. Auch hier wurden Mutantenproteine erzeugt und – in Kooperation mit Prof. Gunter Schneider- auf ihre Struktur-Funktionsbeziehungen hin untersucht. MenD nutzt-neben seinem eigentlichen Donor 2-Ketoglutarat z.B. auch 2-Keto-4-Hydroxyglutarat; dadurch eröffnen sich neue Synthesemöglichkeiten.
Das Gram-negative Bakterium Escherichia coli K-12 ist molekulargenetisch sehr gut untersucht, und wird zunehmend auch in der Biotechnologie für die Produktion von niedermolekularen Substanzen eingesetzt. Wir beschäftigen uns mit der gezielten Veränderung der Stoffwechselwege von E. coli und anderen industriell genutzten Mikroorganismen (Corynebacterium glutamicum) für die Produktion von z.B. Aminosäuren, Oligosacchariden und Feinchemikalien.
Am Beispiel von E.coli -Zellen konnte gezeigt werden, dass der Aromatenbiosyntheseweg (Shikimisäureweg) in Bakterien erfolgreich zur Produktion von aromatischen Aminosäuren wie L-Phenylalanin, L-Tryptophan, p-Aminophenylalanin und Phenylglycin optimiert werden konnte. Ebenso konnten andere, von Chorismat abgeleitete Substanzen wie z.B. Violacein (über die Zwischenstufe L-Tryptophan) gewonnen werden. Weitere Untersuchungen betreffen die Gewinnung von aromatischen Substanzen mit dem Bakterium Corynebacterium glutamicum; hier gibt es eine langjährige Zusammenarbeit mit der Covestro AG (ehemals Bayer Material Sciences) im Rahmen eines von der FNR unterstützten Projekts (Bio4PurPro) zur Gewinnung von BioAnilin aus nachwachsenden Pflanzenrohstoffen. Sowohl bei E. coli als auch bei C. glutamicum zeigte sich dabei, dass die gezielte chromosomale Integration von Genen (z.T. in höheren Genkopienzahl) Vorteile gegenüber der Plasmid-basierten Expression hat.
In einem BMBF-Gemeinschaftsprojekt (ReCOgNice) mit Partnern aus Stuttgart (Prof. Takors, Prof. Sawodny) und von der Univ. Tübingen (Dr. Bonin) untersuchten wir Regulationsvorgänge der C-, O-, und N-Stoffwechselwege von E. coli-Zellen untersucht und konnten dabei eine große Anzahl an definierten E. coli-Stämmen als Reporter für verschiedene Stresszustände konstruieren. In langjährigen DFG-Projekten (gemeinsam mit Prof. D. Weuster-Botz, TU München) untersuchten wir zuerst die Produktion von L-Phenylalanin auf Basis von Glyzerin mit E. coli. In einem vor kurzem abgeschlossenen Fortsetzungsprojekt wurden Stämme, die L-Tryptophan bilden, untersucht. Ziel war die Aufklärung der Stoffwechseladaptation nach dem Wechsel des Wuchsmediums (Kurzzeitfermentationen) und bei z.B. Zufütterung von Shikimat. In Kooperation mit Prof. C. Wittmann (Universität des Saarlandes) hatten wir E. coli-Tryptophan-Produzenten für die Gewinnung von desoxy-Violacein erfolgreich eingesetzt. Diese Arbeiten werden derzeit im Rahmen des DFG-Schwerpunktprojekts (InterZell, SPP2170, in Kooperation mit dem IBVT, Prof. Ralf Takors) fortgeführt mit dem Ziel einer Gewinnung von Violacein mithilfe bakterieller Cokulturen (MiMiCry).
Durch gezielte genetische Eingriffe in den Zentralstoffwechsel von E. coli -Zellen (Unterbrechung der Funktion der Phosphofructokinase) und durch Ausprägung einer Variante der Fruktose-6-Phosphat-Aldolase (FSA, Ala129Ser-Mutante) konnten wir kürzlich einen E. coli-Stamm gewinnen, der einen neuartigen Stoffwechselweg zu Dihydroxyaceton und Glyzerin aufweist.
In einem Projekt der Baden-Württemberg-Stiftung (BWS; Glykomik/Glykobiologie) untersuchten wir zuerst die biotechnologische Herstellung von fucosylierten Oligosacchariden („humane Milch-Oligosaccharide, HMO) mithilfe rekombinanter E. coli-Stämme. Dabei konnten wir z.B. 2´-Fucosyllactose und fucosylierte Lacto-N-tetraose herstellen. In einem weiteren (kürzlich abgeschlossenen BWS-Projekt) untersuchten wir gemeinsam mit Partnern an der Universität Tübingen und dem Leibniz-Zentrum/TU Braunschweig die Bildung von nicht-proteinogenen Aminosäuren wie z.B. Phenylglycin als Bausteine für die Produktion von Derivaten der Glykopeptid-Antibiotika Balhimycin oder Pristinamycin.
Publikationen
(Bei Autoren verschiedener Institute sind die Coautoren des IMB fett hervorgehoben)
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Neuere Buchbeiträge:
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Clapés, P., Sprenger, G.A., Joglar, J. (2008) Novel Strategies in aldolase-catalyzed synthesis of iminosugars. pp. 299-311. In “Modern Biocatalysis: Stereoselective and environmentally friendly reactions” (W.D. Fessner, T. Anthonsen, eds.) Wiley-VCH Verlag, Weinheim.
Castillo, J.A., Parella, T., Inoue T., Sprenger, G.A., Joglar, J., Clapés, P. (2009) Synthesis of D-fagomine by aldol addition of dihydroxyacetone to N-Cbz-3-aminopropanal catalyzed by D-fructose-6-phosphate aldolase. pp. 212-217. In “Practical Methods for Biocatalysis and Biotransformations” (J. Whittall, P. W.Sutton, eds.). John Wiley & Sons, Chichester, U.K.
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Buchbeiträge:
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Sprenger, G.A., & Swings, J. (2005) Genus Zymomonas, In Garrity, G.M. (Hg.) Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology, Second edition,Vol. 2, pp.282-286. The Proteobacteria, Springer Verlag, New York.
Sprenger, G.A. (2007) Aromatic Amino Acids. pp. 93-127. In Amino Acid Biosynthesis – Pathways, Regulation and Metabolic Engineering (Microbiology Monographs Vol.5/2007) (Wendisch, V., Hg.) Springer Verlag, Berlin Heidelberg.
Kontakt
Georg Sprenger
Prof. Dr.Ehemalige Leitung Institut für Mikrobiologie (im Ruhestand)