Analyse und Veränderung ringspaltender Dioxygenasen

AG Prof. Dr. Andreas Stolz

Charakterisierung außergewöhnlicher ringspaltender Dioxygenasen

In früheren Untersuchungen haben wir drei unterschiedliche ringspaltende extradiole Dioxygenase aus S. xenophaga BN6 genetisch und biochemisch charakterisiert und erstmals eine Ringspaltung für ein monohydroxyliertes Aminosalicylat zeigen können (Kuhm et al., 1991; Stolz et al., 1992; Stolz & Knackmuss, 1993a; Heiss et al., 1995, 1997). Hierbei wurde in S. xenophaga BN6 eine außergewöhnliche ringspaltende Dioxygenase identifiziert, die sich bezüglich der Größe der Untereinheiten und der Struktur des Holoenzyms von allen zuvor bekannten extradiolen Dioxygenasen unterschied. Überraschenderweise oxidierte dieses Enzyme 3-Chlorbrenzcatechin durch eine zuvor noch nicht beschriebene distale extradiole Ringspaltung (Heiss et al., 1995). Für dieses Enzym haben wir zunächst grundlegende biochemische Parameter bestimmt und das korrespondierende Gen kloniert.

In diesem System konnte die Fähigkeit zum Umsatz von 3-Chlorbrenzcatechin durch gezielte und ungezielte Mutagenese-Techniken signifikant erhöht werden. Im Rahmen dieser Mutagenese-Versuche wurde erstmals eine Veränderung der Ringspaltungsrichtung extradioler Dioxygenasen aufgezeigt und die klassische proximale Ringspaltung von Alkylbrenzcatechinen zu einem distalen Ringspaltungsmechanismus modifiziert (Riegert et al., 1998, 1999, 2001).

In weiteren Untersuchungen wurden die außergewöhnlichen 4-Sulfocatechol umsetzenden Protocatechuat-3,4-Dioxygenasen aus der Sulfanilsäure abbauenden Mischkultur untersucht. Hierzu wurden die Typ I- und Typ II-Gene der Protocatechuat-3,4-Dioxygenasen aus den Stämmen H. intermedia S1 und A. radiobacter S2 kloniert (Contzen & Stolz, 2000; Contzen et al., 2001). Durch Vergleiche der Aminoäuresequenzen der beiden P34OIIs aus den Stämmen S1 und S2 mit bereits in der Literatur veröffentlichten Sequenzen der Typ I-Enzyme aus anderen Bakterienstämmen und mit Hilfe bekannter Strukturdaten für das katalytische Zentrum der P34O (Typ I) aus Pseudomonas putida konnte der Aminosäurerest Tryptophan(ß149) im katalytischen Zentrum identifiziert werden, der in allen bekannten P34Os vom Typ I konserviert war, aber in den beiden P34O-IIs durch eine sterisch weniger anspruchsvolle Aminosäure (Valin bzw. Isoleucin) ersetzt war.

Der gezielte Austausch dieses Tryptophanrests in der P34O-I vom Stamm S2 durch einen Valinrest erlaubte der mutierten Form des Enzyms den Umsatz von 4-Sulfocatechol. Hierdurch konnten erstmals molekularbiologische Hinweise auf die Grundlagen der Anpassung von Enzymen an den Umsatz naturfremder sulfonierter Verbindungen erhalten werden (Contzen et al., 2001).

Eine weitere außergewöhnliche ringspaltende Dioxygenase wurde in dem 6-Aminonaphthalin-2-sulfonsäure abbauenden Bakterienstamm Pseudaminobacter salicylatoxidans BN12 entdeckt. Dieses Enzym besitzt die zuvor noch nicht beschriebene Fähigkeit, das monohydroxylierte Substrat Salicylat (2-Hydoxybenzoat) durch eine direkte Spaltung des aromatischen Rings zu 2-Oxohepta-3,5-dienoat zu oxidieren. Das Reaktionsprodukt wurde durch spektrometrische und spektroskopische Techniken zweifelsfrei identifiziert (Hintner et al., 2001). Die ringspaltende Dioxygenase wurde zur Homogenität aufgereinigt und es konnte gezeigt werden, dass das gereinigte Enzym neben Salicylat auch verschiedene substituierte Salicylate (z.B. 3-, 4- bzw. 5-Chlor- oder Methylsalicylat) umsetzte. Das kodierende Gen wurde kloniert, sequenziert und funktionell in E. coli überexpremiert. Sequenzvergleiche zeigten, dass die „Salicylat-1,2-Dioxygenase“ offenbar mit Gentisat-1,2-Dioxygenasen und 1-Hydroxy-2-naphthoat Dioxygenasen verwandt ist.

Durch die Analyse der Oxidation unterschiedlicher substituierter Salicylate mittels HPLC/MS-Techniken konnte für den Umsatz in 5-Position halogenierter Salicylate ein Dehalogenierungsmechanismus in Folge einer intramolekularen Lactonisierung nachgewiesen werden (Hintner et al., 2004). Die Kristallstruktur des Enzyms wurde im Rahmen einer Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. F. Briganti (Universität Florenz) aufgeklärt (Matera et al. 2008) und die molekularen Grundlagen der außergewöhnlichen Substratspezifität mit Hilfe verschiedener Mutanten analysiert (Steimer, 2009).

Publikationen zur Analyse und Veränderung ringspaltender Dioxygenasen

Weitere Arbeitsgebiete:
Biodegradation von Azofarbstoffen und sulfonierten Aromaten
Biotransformation von Nitrilen und Amiden

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