Bachelor- und Masterarbeiten

Aromatische Verbindungen werden von Mikroorganismen im Allgemeinen nach der Einführung von zwei Hydroxygruppen in das aromatische System durch sogenannte ringspaltende Dioxygenasen zu nicht aromatischen Verbindungen gespalten. In unserer Arbeitsgruppe wird seit einigen Jahren eine außergewöhnliche ringspaltende Dioxygenase („Salicylat-1,2-Dioxygenase“) untersucht, die auch einfach hydroxylierte Verbindungen umsetzen kann. Kürzlich gelang uns in Zusammenarbeit mit einer italienischen Arbeitsgruppe die Strukturaufklärung dieses Enzyms. Wir versuchen z.Z. mit Hilfe dieser Struktur durch die Erzeugung und Analyse verschiedener Enzymvarianten die molekularen Grundlagen für die außergewöhnliche katalytische Spezifität dieses Enzyms aufzuklären.
Im Rahmen der Arbeiten sollen zunächst durch ortsgerichtete Mutagenese weitere Mutanten erzeugt werden. Im Folgenden sollen durch vergleichende Untersuchungen mit verschiedenen Enzymvarianten Struktur-Funktionsbeziehungen für den Umsatz halogenierter Salicylate ermittelt werden. Hierbei sollen verschiedene spektrophotometrische und chromatographische Techniken zum Einsatz kommen.

Literatur:
Hintner, J.-P., C. Lechner, U. Riegert, A. E. Kuhm, T. Storm, T. Reemtsma & A. Stolz. 2001. Direct ring-fission of salicylate by a salicylate 1,2-dioxygenase activity from Pseudaminobacter salicylatoxidans. J. Bacteriol. 183, 6936-6942.
Hintner, J.-P., T. Reemtsma & A. Stolz. 2004. Biochemical and molecular characterization of a ring-fission dioxygenase with the ability to oxidize (substituted) salicylates(s) from Pseudaminobacter salicylatoxidans. J. Biol. Chem. 279: 37250-37260.
Matera, I, M. Ferraroni, S. Bürger, A. Stolz. F. Briganti. 2008. Salicylate 1,2-dioxygenase from Pseudaminobacter salicylatoxidans: Crystal structure of a peculiar ring cleaving dioxygenase. J. Mol. Biol. 380: 856-868.

Nitrilasen und verwandte Enzyme bilden vielfach spiralförmige enzymatisch aktive Holoenzyme aus, die im Elektronenmikroskop sichtbar gemacht werden können. Möglicherweise können diese Strukturen in der Nanobiotechnologie genutzt werden. Kürzlich konnten wir in Zusammenarbeit mit dem Institut von Prof. Nussberger und einer südafrikanischen Arbeitsgruppe zeigen, dass auch die in unserem Institut seit längerer Zeit untersuchte Nitrilase aus dem Bakterienstamm Pseudomonas fluorescens spiralförmige Strukturen ausbildet, die sich in gewissen Aspekten von den für andere Nitrilasen beschriebenen Strukturen unterscheiden. Im Rahmen der Bachelorarbeit soll versucht werden, optimale Bedingungen für die Ausbildung möglichst gleichförmiger Proteinspiralen zu entwickeln. Außerdem soll untersucht werden, ob es möglich ist die Lage des katalytischen Zentrums des Enzyms über die Produktbildung zu visualisieren.

Literatur:
Kiziak, C., D. Conradt, A. Stolz, R. Mattes & J. Klein. 2005. Nitrilase from Pseudomonas fluorescens EBC 191: Cloning and heterologous expression of the gene and biochemical characterization of the recombinant enzyme. Microbiology 151: 3639-3648.
Thuku, R.N., D. Brady, M.J. Benedik & B.T. Sewell. 2009. Microbial nitrilases: versatile, spiral forming, industrial enzymes. J. Appl. Microbiol. 106: 703-727.

Nitrilasen sind in der Lage, unterschiedlichste chemisch synthetisierte razemische Nitrile enantioselektiv zu Carbonsäuren zu hydrolysieren. Hierbei stellen Aminonitrile eine interessante Gruppe an Substraten dar, da auf diesem Wege prinzipiell verschiedene nicht-proteinogene optisch aktive Aminosäuren synthetisch zugänglich sind. Im Rahmen der geplanten Arbeiten soll zunächst der Umsatz eines einfachen aromatischen Aminonitrils durch verschiedene Nitrilase-Varianten mittels chiraler HPLC im Hinblick auf die Enantioselektivität der Reaktionen hin analysiert werden. Im weiteren Verlauf der Arbeiten sollen durch ortsgerichtete Mutagenese Enzymvarianten mit veränderten Enantioselektivitäten erzeugt werden und Verfahrenskonzepte zur Biotransformation von Aminonitrilen in Gegenwart ionischer Flüssigkeiten erprobt werden.

Literatur:
Wegman, M.A., U. Heinemann, A. Stolz, F. van Randwijk & R.A. Sheldon. 2000. Stereoretentive nitrile hydratase catalysed hydration of D-phenylglycine nitrile. Org. Process Res. Develop. 4, 318-322.
Rustler, S., A. Müller, V. Windeisen, A. Chmura, B. Fernandes, C. Kiziak, & A. Stolz. 2007. Conversion of mandelonitrile and phenylglycinenitrile by recombinant E. coli cells synthesizing a nitrilase from Pseudomonas fluorescens EBC191. Enzyme Microb. Technol. 40:598-606.
Baum, S, F. van Rantwijk & A. Stolz. 2012. Application of a recombinant Escherichia coli whole cell catalyst synthesizing hydroxynitrile lyase and nitrilase activities in ionic liquids for the production of (S)-mandelic acid and (S)-mandeloamide. Adv. Synth. Catal. 354: 113-122.

In den letzten Jahren wurden in unserer Arbeitsgruppe verschiedene rekombinante Ganzzell-Katalysatoren konstruiert, in denen eine funktionelle Kopplung von pflanzlichen Enzymen (sog. Oxynitrilasen) und bakteriellen Nitrilasen erreicht wurden. Diese „bienzymatischen Katalysatoren“ sind in der Lage, aus aromatischen Aldehyden (oder Ketonen) und Cyanid optisch aktive Hydroxycarbonsäuren und Hydroxycarboxamide zu synthetisieren. Im Rahmen der geplanten Arbeiten soll die Synthese von aliphatischen Hydroxycarbonsäuren erreicht werden. Hierzu sollen zunächst adäquate analytische Verfahren zur chiralen Analyse der relevanten Verbindungen etabliert werden. Im weiteren Verlauf der Arbeiten soll dann das synthetische Potential dieser Katalysatoren für die Biosynthese optisch aktiver aliphatischer Hydroxycarbonsäuren und Hydroxycarboxamide aufgeklärt werden.

Literatur:
Sosedov, O., K. Matzer, S. Bürger, C. Kiziak, S. Baum, J. Altenbuchner, A. Chmura, F. van Randwijk & A. Stolz. 2009. Construction of recombinant Escherichia coli catalysts which simultaneously express an (S)-oxynitrilase and different nitrilase variants for the synthesis of (S)-mandelic acid and (S)-mandeloamide from benzaldehyde and cyanide. Adv. Synth. Catal. 351:1531-1538.
Sosedov, O., S. Baum, S. Bürger, K. Matzer, C. Kiziak & A. Stolz. 2010. Construction and application of variants of the arylacetonitrilase from Pseudomonas fluorescens EBC191 which form increased amounts of acids or amides. Appl. Environ. Microbiol. 76:3668-3674.
Baum, S., D.S. Williamson, T. Sewell & A. Stolz. 2012. Conversion of sterically demanding alpha-alpha-disubstituted phenylacetonitriles by the arylacetonitrilase from Pseudomonas fluorescens EBC191. Appl. Environ. Microbiol. 78: 48-57.